Dragă microb

Share Tweet Pin it

De la Pasteur, se știe că tractul gastrointestinal uman este, în esență, un bioreactor de tip flux, în care trăiesc multe microorganisme. Atitudinea oamenilor de știință față de microflora intestinală în această perioadă sa schimbat radical. Acum o sută de ani, marele Ilya Mechnikov, fondatorul teoriei moderne a imunității, pentru crearea pe care a primit Premiul Nobel (pentru două persoane cu adversarul său implacabil, nu mai puțin decât marele Paul Ehrlich), a propus chiar eliminarea colon ca o modalitate de prelungire a vieții. Și pentru cei cărora această măsură părea prea radicală, am recomandat să bei cât mai multă chefiră pentru a suprima, în opinia sa, microbii cu bacterii benefice de acid lactic. După o jumătate de secol, cursul sa schimbat cu 180 de grade. Sa constatat că microflora intestinală normală, precum și pielea și mucoasele îndeplinesc multe funcții utile - de exemplu, suprimă activitatea vitală a microorganismelor patogene care atacă constant corpul. Și în ultimii ani, cei mai curajoși dintre microbiologi au mers chiar mai departe, declarând omul și microbii lui drept un singur superorganism simbiotic.

Dezvoltarea metodelor de biologie moleculară a adus oamenii de știință la un nou nivel de înțelegere a proceselor de simbioză a omului și a microflorei sale, care păreau a fi bine studiate și din studiul căruia nu se așteptau surprize speciale. Creșterea rapidă a vitezei și scăderea costului metodelor de secvențiere a ADN-ului (determinarea secvenței de nucleotide) și creșterea paralelă a puterii computerelor personale și dezvoltarea Internetului a făcut posibilă analiza informațiilor despre regiuni mari ale genomului. După ce au fost descifrate cromozomii a sute de specii bacteriene individuale, a apărut o nouă abordare în genetica microorganismelor - abordarea populației: analizarea genelor tuturor bacteriilor care locuiesc într-o anumită zonă deodată. Desigur, populația "bioreactorului uman" sa dovedit a fi una dintre cele mai importante pentru studiul populațiilor microbiene.

Prima lucrare, care a condus la o nouă vizionare a microbiotei intestinale, a fost publicată în 1999 de către un grup de oameni de știință de la Institutul Național pentru Cercetare Agronomică (Franța) și de la Universitatea din Reading (Regatul Unit). Autorii au decis să aplice metoda de secvențiere a genei ARN 16S la studiul populației microbiene a intestinului.

16S ARN - identificarea bacteriilor

Din moment ce Pasteur, primul pas necesar în determinarea microorganismelor a fost cultivarea lor pe medii nutritive. Dar mulți microbi importanți (și beneficii și patogeni) nu doresc să crească în nici un mediu. Studiu bacterii uncultivable anterior inaccesibile și începe să curețe taxonomia cu totul confuz procariote cunoscute a devenit posibilă odată cu dezvoltarea bioinformatica și apariția tehnicilor de biologie moleculară moderne - reacția în lanț a polimerazei (PCR), care permite o singură bucată de ADN pentru a obține milioane și miliarde de copii exacte, clona izolate de la folosind genele PCR în plasmidele bacteriene și tehnicile de secvențiere pentru secvențele nucleotidice obținute ca rezultat al tuturor acestor elemente suficiente pentru aa Suma Iza.

Un marker ideal pentru identificarea microorganismelor a fost gena care codifică ARN ribozomal 16S (fiecare dintre cele două subunități ale atelierelor de celule ribozomale pentru sinteza proteinelor - constă din molecule de proteine ​​întrețesute și lanțuri de acizi ribonucleici).

Această genă este în genomul tuturor bacteriilor cunoscute și arhealelor, dar este absentă în eucariote și viruși și dacă ați găsit secvența nucleotidică caracteristică, cu siguranță aveți de-a face cu genele de procariote. (Pentru a fi foarte precis, gena 16S ARN acolo și în eucariotele, dar nu și în cromozomi nucleare și mitocondrial Acest lucru confirmă încă o dată că mitocondriile -. Urmașii Distant de bacterii simbiotice ale primelor organisme eucariote.)

Această gena are ambele regiuni conservatoare, la fel pentru toți prokariotele și speciile specifice. Locurile conservatoare servesc pentru prima etapă a reacției în lanț a polimerazei - atașarea ADN-ului de testare la primeri (locurile de semințe ale ADN-ului la care lanțul nucleotidic studiat trebuie să se alăture pentru a începe analiza restului secvenței) și specificul speciilor - pentru a determina speciile. În plus, gradul de similitudine al parcelelor specifice speciilor reflectă foarte bine legătura evolutivă a diferitelor specii.

Un bonus suplimentar este că pentru clonare și analiză ulterioară, puteți utiliza ARN ribozomal în sine, care este prezent în orice celulă într-o cantitate mult mai mare decât gena corespunzătoare. Numai tu trebuie să-l rescrieți mai întâi în ADN folosind o enzimă specială - revers transcriptază.

Secvențele de nucleotide ARN 16S ale tuturor bacteriilor cunoscute și arhaice (aproximativ 10.000 de specii) sunt disponibile pe scară largă. Secvențele identificate sunt comparate cu cele din bazele de date și identifică cu precizie tipul de bacterii sau se declară aparținând următoarelor specii necultivate.

Recent, a fost efectuată o revizuire intensivă a clasificării vechi, fenotipice a bacteriilor, pe baza unor criterii slab formalizate - de la apariția coloniilor la preferințele alimentare și de a fi colorate cu diferite coloranți. Noua sistematică se bazează pe criterii moleculare (ARN 16S) și repetă doar parțial fenotipic.

Secvențele de codificare ale 16S ARN prin PCR a fost recuperat direct din „mediu“ - 125 de miligrame de om, rău, scaun, a fost inserat în plasmida de E. coli (nu pentru că intestinal, și pentru ca Escherichia coli - una dintre workhorse preferat biologi moleculare ) și din nou izolate din cultura bacteriilor propagate. Astfel, a fost creată biblioteca genei ARN 16S a tuturor microorganismelor din probă. Apoi, 284 de clone au fost selectate aleator și secvențiate. Sa constatat că doar 24% din secvențele de ARN 16S obținute aparțin unor microorganisme cunoscute anterior. Pentru mai mult de o sută de ani, trei sferturi din microflora din intestinele fiecărei persoane a evitat atenția cercetătorilor înarmați cu metodele de microbiologie clasică! Oamenii de știință pur și simplu nu au putut găsi condițiile pentru cultivarea acestor bacterii, deoarece cei mai capricioși locuitori ai intestinului au refuzat să crească pe mediile microbiologice tradiționale.

Astăzi, folosind metode moleculare, sa stabilit că 10 din 70 de taxoni mari de bacterii sunt reprezentate în microbiota unui adult. Aproximativ 90% dintre microbii noștri aparțin tipului Firmicutes (aceasta include, de exemplu, celebrul lactobacilii - principalul „vinovații“ laptele acrire) și Bacteroidetes - obligã anaerobe (organisme care pot trăi numai în absența oxigenului), care sunt adesea folosite ca un indicator al poluării apelor naturale de canalizare. Restul de 10% din populație împărțită între taxoni Proteobacteria (acestea includ, printre altele, E. coli), Actinobacteria (de la una dintre speciile de actinomicete streptomicina antibiotic a fost izolat), Fusobacteria (locuitori normale ale cavității bucale și adesea cauza periodontita), Verrucomicrobia (recent, în o sursă geotermală sa dovedit a fi o specie a acestor microbi care se hrănesc cu metan, care este abundent în intestin datorită activității vitale a altor microorganisme), Cyanobacteria (acestea sunt adesea denumite vechi "alge alb-verde"), Spirochaeates tew, nu palid), Synergistes și VadinBE97 (ce fel de animale sunt acestea, întrebați creatorii noii sistematice procariote).

În ciuda faptului că compoziția speciilor microorganismelor intestinale este mai degrabă monotonă, raportul cantitativ dintre reprezentanții anumitor grupuri sistemice din microbiota diferitelor persoane poate varia foarte mult. Dar ce este microflora intestinală normală și care sunt modalitățile de formare a acesteia?

Aceasta intrebare a fost raspuns intr-o lucrare din 2007 a unui grup de biologi americani condusi de Patrick Brown de la Universitatea Stanford. Ei au urmărit formarea de microbioterapie la 14 nou-născuți în timpul primului an de viață. Autorii au reușit să stabilească mai multe surse de colonizare a tractului gastrointestinal. Microbiota copiilor a avut asemănări cu microflora mamei: vaginale, fecale sau microflore ale probelor de lapte matern. În funcție de izvoarele colonizării, în prima microfloră intestinală a sugarilor au existat specii diferite în timpul primului an de viață. Aceste diferențe au rămas semnificative pe întreaga perioadă de studiu, dar la vârsta de un an, formarea microbiotei adulte a devenit vizibilă. Datele interesante au fost obținute pe baza exemplului unei perechi de gemeni. Microflora din ele era aproape identică în compoziție și se schimba în același fel. Această constatare a evidențiat rolul enorm al componentei umane a perechii microbiotor-gazdă în formarea populației microflorei intestinale. Pentru puritatea experimentului, desigur, ar fi necesar să separăm bebelușii încă în spital - o poveste minunată pentru un film indian! De-a lungul anilor, ei se cunosc reciproc prin analiză... Dar datele din alte lucrări au confirmat ipoteza că particularitățile individului, inclusiv elementele ereditare ale biochimiei umane, au o mare influență asupra compoziției microbiotei.

Microbian în noi mai mult decât uman

În plus față de studiul anumitor tipuri de microfloră intestinală, în ultimii ani, mulți cercetători au studiat metagenul bacterian - un set de gene ale tuturor microorganismelor într-o probă a conținutului intestinului uman (fie spălată din piele, fie dintr-o mostră de la fundul mării). În acest scop, cel mai automatizat, computerizat și tehnologii de secventiere ADN de înaltă performanță, care permit analizarea secvențelor nucleotidice scurte, colecta puzzle mai multe „litere“ coincidente la capetele acestor porțiuni, se repetă multiplu această procedură pentru fiecare piesă a genomului și a primi decodificare de gene individuale și cromozomi la o rată până la 14 milioane de nucleotide pe oră - ordine de mărime mai repede decât aceasta sa făcut acum câțiva ani. Deci sa constatat că microbiota intestinului uman are aproximativ 100 trilioane de celule bacteriene - de aproximativ 10 ori mai mult decât numărul total de celule din organismul gazdă. Setul de gene care alcătuiesc metagenomul bacterian este de aproximativ 100 de ori mai mare decât setul de gene ale corpului uman. Dacă vorbim despre cantitatea de reacții biochimice care au loc în cadrul populației microbiene, din nou, ea de multe ori mai mare decât cea a corpului uman. Reactorul bacterian implementează în organismul gazdei lanțuri metabolice pe care nu le poate suporta - de exemplu, sinteza vitaminelor și a precursorilor acestora, descompunerea anumitor toxine, descompunerea celulozei la polizaharidele digerabile (la rumegătoare) etc.

Studiile efectuate în laboratorul lui Jeffrey Gordon (Școala de Medicină a Universității din Washington, St. Louis, Missouri) au permis să asocieze diversitatea speciilor bacteriilor din tractul gastrointestinal cu dieta și trăsăturile metabolice ale individului. Rezultatele experimentului au fost publicate în ediția din decembrie 2006 a Nature. Experiența de un an a sugerat stabilirea unei corelații între excesul de greutate la om și compoziția populației microbiene a intestinelor sale. O duzină de oameni grași care au acceptat să-și pună burta pe altarul științei au fost împărțiți în două grupuri. Unul a mers pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi, cealaltă o dietă cu carbohidrați scăzut. Toți voluntarii au pierdut greutatea și, în același timp, au schimbat raportul celor două grupe principale de microorganisme intestinale: numărul celulelor Firmicutes a scăzut, iar numărul de bacteroide, dimpotrivă, a crescut. La o dietă cu conținut scăzut de grăsimi, o astfel de schimbare a devenit vizibilă mai târziu - după ce pacienții au pierdut 6% din greutatea lor și pe o dietă cu conținut scăzut de carbohidrați - după ce au pierdut primele kilograme (2% din greutatea lor inițială). În acest caz, schimbarea compoziției microflorei a fost cu atât mai pronunțată, cu atât mai puțin a fost greutatea participanților la experiment.

În paralel, în același laborator, au fost efectuate experimente pe șoareci de laborator care purtau o mutație în gene pentru leptină, "hormonul de sațietate", o proteină care este sintetizată în celulele țesutului adipos și contribuie la formarea unui sentiment de sațietate. Șoarecii care au deteriorat ambele copii ale acestei gene (această mutație este indicată de indicele Lep ob), consumă cu 70% mai mult decât tipul sălbatic, cu toate consecințele care rezultă. Conținutul de Firmicutes în intestine este de o dată și jumătate mai mare decât cel al liniilor heterozigote, cu o singură alelă defectă (ob / +) și homozigotă pentru gena normală a liniilor de tip sălbatic (+/-).

Influența microflorei asupra metabolismului "proprietarului", cercetătorii au verificat un alt model - șoareci gnotobioticheskimi.

Astfel de animale, care din momentul nașterii trăiesc în camere sterile și nu au întâlnit niciodată un singur microb în viața lor, nu sunt adesea folosite în cercetarea biomedicală. Sterilizarea absolută în musculatură, rabbituri și în special vărsarea de capră - este costisitoare și supărătoare, iar după întâlnirea cu primul microb sau virus, creaturile sărace vor muri sau vor deveni inadecvate pentru experimente ulterioare. Ce se întâmplă în gnotobiotov cu sistemul imunitar este o poveste separată și mănâncă timp de trei și, în același timp, pielea și oasele din cauza lipsei unei componente microbiene a digestiei.

După transplantul microflorei de la donatorii obezi (ob / ob), șoarecele gnatobiot a fost îngroșat de aproape o dată și jumătate (47%) în două săptămâni. Cei care au fost "însămânși" cu microflora de la donatori de tip sălbatic (+ / +) cu greutate normală, au recuperat doar cu 27%.

Rezultatele studiului suplimentar al modificărilor survenite în organismul microbiologic al șoarecilor simbioși confirmă în mod strălucit ipoteza că microbiota indivizilor obezi contribuie la o prelucrare mai profundă a alimentelor. Comparația probelor ADN de scaun de la șoarecii obezi și normali a arătat că microbiomele obezității sunt saturate cu gene enzimatice care permit o degradare mai eficientă a polizaharidelor. Intestinele de șoareci grași au conținut cantități mari de produse finale de fermentație - compuși ai acizilor acetici și butirici, ceea ce indică o prelucrare mai profundă a componentelor alimentare. Calorimetric (din cuvântul "calorii"!) Analiza probelor de scaun a confirmat acest lucru: scaunul de soareci ob / ob conținea mai puține calorii decât soarecii de tip sălbatic, care nu absorbeau complet energia din alimente.

În plus față de informațiile importante cu privire la componenta „germeni“ de obezitate, autorii au fost in masura sa demonstreze similitudinea fundamentală între microflora oamenilor obezi si soareci, care deschide noi perspective în studiul problemei excesului de greutate, și poate - și pentru a rezolva această problemă prin „transfer“ microfloră sănătoasă sau formarea sa la pacienții obezi.

Faptul că microbiota poate controla metabolismul gazdei nu mai este îndoielnică. Cercetările lui Gordon privind excesul de greutate au permis un pod de tratare a bolilor metabolice, cum ar fi epuizarea generală care afectează copiii de la unu la patru ani în țările sărace cu un climat tropical - marasmus (acest cuvânt are doar o relație lingvistică cu marasmus: literalmente înseamnă epuizare, extincție) și kwashiorkor (în limba uneia dintre triburile din Ghana, kwashiorkor - "băiat roșu"). Apariția bolilor este asociată cu o lipsă de proteine ​​și vitamine în timpul tranziției de la alăptare la alimentele adulte. Dar boala afectează selectiv copiii ai căror frați și surori nu au avut probleme cu tranziția la dieta tradițională pentru regiune. Studiile au arătat că microflora intestinală a copiilor bolnavi este foarte diferită de microflora părinților lor, precum și din microflora fraților și surorilor sănătoși. În primul rând, sa observat absența aproape completă în populația intestinală a Bacteroideților și dominarea speciilor rare aparținând tipurilor de Proteobacteria și Fusobacteria. După ce copiii bolnavi (cu atenție, pentru a nu supradoza!) Au fost hrăniți intensiv cu alimente proteice, microbiota lor a devenit similară cu cea normală, cum ar fi în rude, cu o predominanță de Bacteroidetes și Firmicutes.

Studiile recente nu numai că au schimbat în mod fundamental înțelegerea actuală a microflorei intestinale umane, dar au contribuit și la apariția unui concept care consideră microbiota intestinală ca un "organ" adițional multicelulare a corpului uman. Un organ compus din diferite linii celulare capabile să comunice atât între ele, cât și cu organismul gazdă. Organismul care redistribuie fluxurile de energie, efectuează reacții fiziologice importante, schimbări sub influența mediului și autoregenerări atunci când schimbările sunt cauzate de condițiile externe.

Continuarea de cercetare „organism bacterian“ poate și ar trebui să conducă la o înțelegere a legilor funcționării sale, dezvăluirea relațiilor sale delicate cu gazda și, în consecință, apariția unor noi metode de combatere a bolilor umane prin tratarea specifică a disfuncțiilor ambelor componente metaorganizma.

Valery Poroiko, Ph.D.
Universitatea din Chicago, Departamentul de Chirurgie Generală
Portalul "Eternul Tineret" www.vechnayamolodost.ru

Versiunea de jurnal a articolului publicat în Mecanica populară nr. 4-2008

Identificarea speciilor de bacterii prin secvențierea genei 16S a ARN-ului ribozomal, rolul și locul metodei în diagnosticul infecțiilor bacteriene. Finalizat: Saveliev. - prezentare

Prezentarea a fost publicată acum 4 ani de Ludmila Shumikhina

Prezentări înrudite

Prezentarea clasei a XI-a pe tema: "Identificarea speciilor de bacterii prin secventierea genei 16S a ARN-ului ribozomal, rolul si locul metodei in diagnosticul infectiilor bacteriene." Finalizat: Saveliev. Descărcați gratuit și fără înregistrare. - Transcriere:

1 Identificarea speciilor de bacterii prin secvențierea genei 16S a ARN-ului ribozomal, rolul și locul metodei în diagnosticul infecțiilor bacteriene : Cand. biol. Afonyushkin Vasily Nikolaevich dr biol. Afonyushkin Vasiliy Nikolaevich

2 Obiective: 1. Să stăpânească electroforeza ADN-ului într-un gel de agaroză 2. Pentru a învăța metoda de analiză a rezultatelor secvențiere și realizează construcția de secvențe de nucleotide, fragmente de gene 16 S ARN ribozomal al izolatelor obținut maestru din genul Bacillus 1. Electroforeza ADN-ul într-un gel de agaroză 2. Pentru a afla metoda pentru analiza rezultatelor secventierea și realizează construirea secvențelor nucleotidice ale fragmentelor genei 16S a ARN-ului ribozomal al izolatelor obținute din genul Bacillus 3. Examinează perspectivele utilizării în comun a metodelor de secvențiere și biochimie identificarea bacteriilor 3. Studierea posibilităților de partajare a metodelor de secvențiere și identificare biochimică a bacteriilor Obiectiv: Studierea posibilităților metodei de identificare specifică a bacteriilor folosind metoda de secvențiere a genei 16S a ARN-ului ribozomal în combinație cu metodele tradiționale de identificare.

3 materiale și metode Culturi pure de izolate au fost însămânțate pe MPA și, după ore de incubare, s-a preparat suspensie bacteriană pe tampon fosfat-salin. Culturile au fost colorate de Gram și microscopic. Evaluate următoarele proprietăți biochimice: Citrat de eliminare, malonat, glucoză, lactoză, manitol, zaharoză, inozitol, sorbitol, arabinoza, maltoza, fenilalanină, formarea de indol, hidrogen sulfurat, atsetilmetilkarabinola (Reacția Foges- Proskauer), prezența beta-galactozidaza, ureazei, decarboxilaza arginină și lizină, arginină hidrolază. Culturile au fost testate pentru activitățile de catalază, citocrom oxidază, formarea de nitriți, sinteza pigmenților, rezistența la antibiotice, studierea proprietăților culturale și morfologice. Beta-galactozidaza și tritofandezaminaznuyu activitatea glyukoronidaznuyu a fost testat pe mediu Uriselekt 4 (BioRad) ADN-ul a fost izolat prin vizualizare fenolhloroformennym determinat pe baza secvențierea 16S genei ribozomale a fragmentului ARNi distanțierului intergenicâ de ARN ribozomal și 16-23S pluralitatea caracteristici biochimice, culturale și morfologice.

4 Proprietăți culturale: culturile crescute nu au crescut pe mediul Endo, adică nu se referea la enterobacterii, cultivate pe agar carne-peptonă în condiții aerobe la 37 ° C Proprietăți tinctoriale: culturi cultivate examinate microscopic și Gram colorare cu care a permis să se stabilească faptul că cultura obținută sunt de spori Gy + bete Caracteristici Cultures

5 Designul studiului: ADN-ul a fost izolat din culturile cultivate și PCR a fost creat cu primeri universali, drept rezultat am amplificat un fragment al genei 16S a ARN-ului ribozomal

6. O soluție cu un primer este distribuită în 4 eprubete, fiecare dintre acestea conținând 4 deoxinucleotide dATP, dTid, dTPP (unul dintre acestea este marcat cu un izotop radioactiv) și unul din patru 2; acesta este activat în toate pozițiile amestecului de lanț în creștere, iar după atașarea acestuia, creșterea lanțului se oprește imediat. Ca rezultat, în fiecare din cele patru tuburi, cu participarea ADN polimerazei, se formează un set unic de oligonucleotide cu lungimi diferite, incluzând secvența de primer. Apoi, la tuburi se adaugă formalid pentru diferențierea lanțurilor, iar electroforeza pe gel de poliacrilat se efectuează pe patru benzi. Se efectuează radiografia, care vă permite să "citiți" secvența nucleică a segmentului ADN care urmează să fie secvențiată. În biochimie și biologie moleculară, electroforeza este utilizată pentru a separa macromoleculele de proteine ​​și acizii nucleici (precum și fragmentele lor). Există multe varietăți ale acestei metode. Această metodă își găsește o largă aplicare pentru separarea amestecurilor de biomolecule în fracțiuni sau substanțe individuale și este utilizat în biochimie, biologie moleculara, diagnostic clinic, biologie populatie (pentru studierea variației genetice) și dr.belkovnukleinovyh acizilor Electroforeza această deplasare electrocinetic fenomenul fazei dispersate (coloid sau proteină soluții) într-un mediu lichid sau gazos sub acțiunea unui câmp electric extern Fenomenul electrochinetic al câmpului electric Electroforeza Proiectarea studiului: Produsele PCR au fost separate prin electroforeză pe gel de agaroză. Metoda Sanger

7 Rezultatele propriei noastre cercetări Fig.1 Rezultatele electroforezei capilare a unui fragment din gena 16S a ARN-ului ribozomal

8 Figura 2 copac filogenetic construit pe baza rezultatelor alinierii unui fragment al genei 16S a ARN-ului ribozomal

9 Rezultatele cercetării proprii Pic. 3 Rezultatele comparării secvenței nucleotidice

10 Rezultatele culturilor studiilor biochimice folosind testul PBDE Proprietățile biochimice ale tulpinii B.licheniformis: citratul utilizare negativă, malonat negativ, citrat de sodiu + glucoză lizină negativ negativ, arginină negativă, ornitina negativ, fenilalanină negativ, indol negativ, ureazei atsetilmetilkarabinol pozitiv negativ sulfurat negativ, pozitiv la glucoză, b-galactozidază pozitivă, lactoză negativă, becul pozitiv, zaharoză pozitivă, inozitol pozitiv oh, sorbitolul este pozitiv, maltoza este pozitivă

11 Concluzie Identificarea specifică a microorganismelor bazate pe secvențiere poate fi "standardul de aur" al diagnosticării de laborator, totuși acuratețea metodei este limitată de exactitatea și exhaustivitatea bazelor de date GenBank și, prin urmare, necesită utilizarea suplimentară a testelor de confirmare.

16s rna analiză

Biotehnologia, 2005, №6, p 3-11

Se propune o metodă de identificare a microorganismelor bazată pe analiza polimorfismului de lungime al fragmentelor de restricție (PDFR) a unui produs PCR al genei ARN 16S cu o lungime de 1500 nucleotide. A fost selectat un set de 6 endonucleaze de restricție (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI și RsaI), ceea ce permite identificarea unei game largi de microorganisme utilizând PCGF.
Au fost izolate patru izolate de fosfatază alcalină termolabilă din izolate naturale de apă de mare. Analiza PDFR pentru aceste tulpini în comparație cu rezultatele calculate obținute pentru genele ARN 16S ale diferitelor microorganisme a făcut posibilă stabilirea faptului că producătorii identificați aparțin genului Alteromonas.

Pe lângă metodele tradiționale de identificare a microorganismelor care utilizează caracteristicile culturale și morfologice, precum și reacțiile chimice și biochimice [1], metodele de determinare a microorganismelor bazate pe compararea secvențelor nucleotidice ale diferitelor gene de microorganisme [2-4] și analiza polimorfismului lungimilor fragmentelor de restricție ADN obținute ca urmare a amplificării genelor bacteriene individuale [5, 6]. Genele care codifică ARN ribozomal 16S și 23S sunt cele mai potrivite pentru identificare, deoarece sunt prezente în toate celulele bacteriene și sunt specifice genelor pentru majoritatea microorganismelor [7-9]. Utilizarea unui fragment de ADN care conține ambele gene ARN 16S și 23S și distanța între ele, care este mai variabilă, poate fi utilizată pentru a identifica speciile și subspecii apropiate ale microorganismelor [10].

Lucrarea de față prezintă rezultatele analizei RFLP a produsului PCR de 1500 nucleotide în lungime pentru diferite microorganisme și a demonstrat că utilizarea de restricție endonucleaze 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, Mspl, BstMBI Rsal și poate identifica în mod fiabil majoritatea microorganismelor. În această lucrare au fost identificați 4 noi producători de fosfatază alcalină termolabilă și folosind metoda propusă, a fost efectuată o analiză comparativă a PDPR pentru identificarea acestor microorganisme. Pe baza comparației, sa concluzionat că producătorii găsiți aparțin genului Alteromonas.

CONDIȚII EXPERIMENTALE

Pentru a identifica producătorii de fosfatază alcalină termolabilă, 50 μl de apă de mare au fost măcinate pe suprafața de agar nutritiv și analizate așa cum este descris în [11]. Producerea biomasei de microorganisme sa realizat prin creșterea producătorilor la 20 ° C într-un bulion conținând 1% tryptonă (AGS GmbH, Germania), 0,5% extract de drojdie (aceeași companie) și apă sărată (NaCl - 27,5,2 - 5, MgS044 - 2, CaCI2 - 0,5, KCI - 1, FeS04 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Supa de însămânțare a fost distribuită în 200 ml în baloane de balansare de 700 ml și s-a agitat la 150 rpm timp de 16 ore.

Izolarea ADN-ului cromozomal a fost efectuată conform metodei din [13].

Amplificarea genei 16S a ARN-ului ribozomal a fost efectuată utilizând o reacție în lanț a polimerazei așa cum este descris în [14].

Reacția de restricție a ADN-ului amplificat a fost efectuată timp de 4 ore la 37 ° C în 20 pl din amestecul de reacție conținând 2 unități. act. Restricase Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI sau RsaI produse de NPO SibEnzyme, în tamponul corespunzător. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 5 pl de soluție stop care conține EDTA 0,1 M, albastru de bromfenol 0,05% și zaharoză 40%.

Se efectuează separarea prin separare electroforetică a produselor din ADN-ul amplificat cu restricție în 2% agaroză (Sigma) în tampon acetat de tris cu bromură de etidiu (0,5 mg / l) la 120 V timp de 4 ore.

Pentru a determina lungimea fragmentelor de ADN, au fost utilizați markeri de greutate moleculară ADN (markeri ADN 100bp +1,5 Kb, NPO SibEnzyme). Stabilirea lungimilor restricțiilor obținute a fost efectuată utilizând programul de calculator Gel Pro Analyzer, versiunea 4.0.00.001. Identitatea procentuală a lungimilor fragmentului a fost calculată pentru fiecare pereche de microorganisme, comparând modelele de restricție separat pentru fiecare enzimă de restricție. Când au fost comparate lungimile de restricție, fragmentele ADN au fost considerate identice, lungimea cărora a diferit cu nu mai mult de 5%.

Pentru a compara datele experimentale cu secvențele genei ARN 16S publicate, a fost utilizată o bancă de date genetică a secvențelor secvențializate.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Din izolații naturale de apă de mare, am izolat patru tulpini - producător de fosfatază termolabilă, desemnate ca 20, 27, 48 și tulpina descrisă mai sus [11] utilizând metode tradiționale ca Alteromonas undina. Pentru a identifica tulpinile obținute din biomasa microorganismelor cultivate într-un mediu nutritiv lichid cu adăugarea de săruri de mare, a fost izolat ADN cromozomial.
Apoi, ADN cromozomal a fost utilizat în reacția în lanț a polimerazei pentru a amplifica gena 16S a ARN-ului ribozomal. Produsul de amplificare a fost tratat independent cu 6 endonucleaze de restricție diferite. Toate restrictazele utilizate de noi au un situs de recunoaștere a tetranucleotidelor, care face posibilă obținerea de la 3 la 8 fragmente ADN ca urmare a clivajului produsului de amplificare, care are o lungime de aproximativ 1500 nucleotide. Enzimele de restricție Sse9I și Tru9I utilizate au, respectiv, situsurile de recunoaștere AATT și TTAA, în timp ce enzimele de restricție BsuRI și MspI se taie prin siturile GGCC și CCGG. Locațiile de restricție BstMBI și RsaI, respectiv GATC și GTAC, conțin toate cele patru nucleotide. O astfel de selecție a endonucleazelor de restricție, în opinia noastră, ar trebui să ofere universalitate în identificarea microorganismelor atât cu genomi bogați în AT, cât și cu GC. Din punct de vedere cantitativ, utilizarea de doar șase restricții diferite considerăm optimă, deoarece utilizarea de endonucleaze de restricție 1 sau 3, așa cum se sugerează în mai multe studii [10,15] nu poate detecta polimorfisme pentru identificarea organismelor strâns înrudite sau, în mod alternativ, duce la diferente prea mari, iz pentru una sau mai multe mutații aleatorii. În același timp, utilizarea a 10 endonucleaze de restricție diferite nu conduce la identificarea suplimentară a polimorfismului lungimii fragmentului de restricție al ADN și este în mod evident excesiv [9].
Figura 1 prezintă modele de simulare computerizată a restricției genelor 16S pentru ARN, un set de șase enzime de restricție propuse de noi (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI și RsaI). Genele ARN 16S sunt luate din banca genetică a secvențelor secvențializate. Alegerea microorganismelor a fost destul de aleatorie. Toate bacteriile aparțin unor genuri diferite și reprezintă microorganisme gram-negative și gram-pozitive. Se vede că pentru toate microorganismele are propriul model unic de un set de restricții. Numărul fragmentelor de ADN variază de la 23 la 30 (fragmentele cu lungimea mai mică de 100 de perechi de baze nu sunt luate în considerare). Rezultatele de calcul al identității procentuale a lungimilor fragmentelor de ADN (fragment de restricție lungimi identice considerate diferă cu cel mult 5%) pentru diferite perechi de microorganisme prezentate în tabelul 1. Acest tabel prezintă doar o parte din posibile perechi de microorganisme prezentate în Fig. 1. Dar rezultatele comparative prezentate sunt destul de caracteristice și ne permit să vedem că identitatea procentuală a lungimilor fragmentelor ADN variază de obicei de la 12-28% pentru reprezentanții genelor diferite de microorganisme. Astfel, datele prezentate arată că modelul de restricție al genelor ARN 16S cu setul de enzime de restricție oferite de noi poate servi drept bază pentru identificarea genului celulelor bacteriene.

Fig. 1. Modelul calculat teoretic de separare electroforetică a ARN 16S produșilor de amplificare a genei după tratamentul cu enzime de restricție Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), Mspl (4), BstMBI (5) și Rsal (6). Piesele M - marker de greutate moleculară

Valoarea ARN-ului 16S în sistematică. Hibridizarea moleculară a ARN 16S.

Hibridizarea moleculară a ARN 16S. Ribosomul procariotic este alcătuit din 3 subunități, mari (23S), (5S) și (16S). Gene 16S ARNm are următoarele proprietăți importante în filogenie:

1. Ribozomii ARN sunt universali pentru diferite specii, cum ar fi ribozomii înșiși. 2. Molecula rRNA 16S este conservatoare și este mai puțin susceptibilă de schimbări în evoluția biologică. Rata de schimbare a genei 16S rRNA în diferite bacterii simbiotice a fost de 2-4% din substituțiile nucleotidice de peste 60 Myr.3. Gena rRNA 16S are atât regiuni ultraconservate, cât și regiuni variabile (domenii), ceea ce face posibilă evaluarea relațiilor de rudenie îndepărtate și apropiate.4. În plus, sa constatat că cistronii ARN nu sunt implicați în procesele de transfer genetic interspecific. Mărimea genei (în procariote, este de aproximativ 1550-1640 bp în lungime) este optimă din punctul de vedere al reducerii erorilor statistice. O secvență completă poate fi determinată într-o singură secvențiere utilizând metoda Sanger. Comparație între directoarele nucleotidice. Metoda a fost folosită la începutul anilor 80 și a avut o mare importanță istorică în sistematica bacteriilor. În același timp, molecula ARN (rRNA 16S) a fost tratată cu ribonuclează T, care scindează molecula în resturi de guanină. Dimensiunea fragmentelor obținute nu a fost mai mare de 20 de nucleotide. Oligonucleotidele rezultate au fost separate prin electroforeză bidimensională, secvențate și au fost compilate un catalog care caracterizează în mod specific molecula r ARN. Când au fost comparate cataloagele, au fost luate în considerare fragmente cu o lungime de cel puțin 6 nucleotide. Prin aplicarea coeficienților de similaritate între cataloage, a fost construit pentru prima oară un arbore filogenetic comun pentru procariote. Riboprinting. Metoda se bazează pe analiza de restricție a genelor rRNA. Pentru aceasta, ADN-ul total este izolat din celulă. Au fost luate două primeri omoloage regiunilor flancare foarte conservate ale genei 16S rRNA (gena subunității mici - ss rDNA) și s-a efectuat PCR. Fragmentele sunt procesate cu câteva endonucleaze de restricție, iar produsele de restricție pentru fiecare dintre endonucleaze sunt separate pe un gel de agaroză împreună cu profilul ADN-ului standard de mărime. Lungimea fragmentului polimorfism apare datorită faptului că o parte din situsurile de restricție intră în domeniile conservatoare ale genei și unele - în domenii variabile. În această parte a fragmentelor vor fi comune tuturor speciilor din eșantion. Prin numărul de fragmente comune și diferite, este posibil să se calculeze distanța genetică între specii. Utilizarea a 12 enzime de restricție cu situri de recunoaștere de lungime de 4 nucleotide face posibilă acoperirea a 10-15% din lungimea genei rSNA 16S prin analiză fără secvențiere.

Dragă microb

Valery Poroiko,
Ph.D., Universitatea din Chicago, Departamentul de Chirurgie Generală
Mecanică populară ı4, 2008

Cu doar o sută de ani în urmă, microbii care trăiau în intestinul uman erau considerați paraziți și dăunători. În ultimii ani, microbiota umană a fost numită un fel de organ al corpului nostru, necesară pentru funcționarea normală a corpului.

De când a trecut Pasteur, sa știut că tractul gastrointestinal uman este în esență un bioreactor de tip flux, în care locuiesc multe microorganisme. Atitudinea oamenilor de știință față de microflora intestinală în această perioadă sa schimbat radical. Acum o sută de ani, marele Ilya Mechnikov, fondatorul teoriei moderne a imunității, pentru crearea pe care a primit Premiul Nobel (pentru două persoane cu adversarul său implacabil, nu mai puțin decât marele Paul Ehrlich), a propus chiar eliminarea colon ca o modalitate de prelungire a vieții. Și pentru cei cărora această măsură părea prea radicală, am recomandat să bei cât mai multă chefiră pentru a suprima, în opinia sa, microbii cu bacterii benefice de acid lactic. După o jumătate de secol, cursul sa schimbat cu 180 de grade. Sa constatat că microflora intestinală normală, precum și pielea și mucoasele îndeplinesc multe funcții utile - de exemplu, suprimă activitatea vitală a microorganismelor patogene care atacă constant corpul. Și în ultimii ani, cei mai curajoși dintre microbiologi au mers chiar mai departe, declarând omul și microbii lui drept un singur superorganism simbiotic.

Dezvoltarea metodelor de biologie moleculară a adus oamenii de știință la un nou nivel de înțelegere a proceselor de simbioză a omului și a microflorei sale, care părea bine studiate și nu se aștepta la surprize speciale din studiul ulterior. Creșterea rapidă a vitezei și scăderea costului metodelor de secvențiere a ADN-ului (determinarea secvenței de nucleotide) și creșterea paralelă a puterii computerelor personale și dezvoltarea internetului a făcut posibilă analizarea informațiilor despre regiuni genomice mari. După ce au fost descifrate cromozomii a sute de specii bacteriene individuale, a apărut o nouă abordare în genetica microorganismelor bazate pe populație: analiza genelor tuturor bacteriilor dintr-o anumită zonă dintr-o dată. Desigur, populația "bioreactorului uman" sa dovedit a fi una dintre cele mai importante pentru studiul populațiilor microbiene.

Prima lucrare, care a dus la o privire complet nouă la microbiota intestinală, a fost publicată în 1999 de către un grup de cercetători de la Institutul Național pentru Cercetare Agronomică (Franța) și de la Universitatea din Reading (Marea Britanie). Autorii au decis să aplice metoda de secvențiere a genelor ARN 16S la studiul populației microbiene a intestinului (vezi bara laterală).

16S PHK - ID-ul bactericilor

Primul pas în determinarea microorganismelor este cultivarea lor pe medii nutritive. Dar un număr de microbi nu doresc să crească în nici un mediu.

Tehnici moderne
Studiu anterior inaccesibile non-bacterii culturable și încep să impună ordine în taxonomia absolut confuză deja cunoscută procariotă a devenit posibilă odată cu dezvoltarea bioinformatica și apariția tehnicilor moderne de biologie moleculara - PCR permite o regiune de ADN pentru a primi miliarde de replici, donarea genei selectate în plasmidele bacteriene și secvențierea secvențelor metodologii nucleotide obținute în cantitate suficientă pentru analiză. Un marker ideal pentru identificarea microorganismelor dovedite genei 16S care codifică ARN ribozomal (fiecare dintre cele două subunități ribozomale - ateliere de sinteza proteinelor celulare - este format din lanturi întrepătrunse de molecule de proteine ​​și acizi ribonucleic).

Perfect marker
Această genă este în genomul tuturor bacteriilor cunoscute și arhealelor, dar este absentă în eucariote și viruși și dacă ați găsit secvența nucleotidică caracteristică, cu siguranță aveți de-a face cu genele de procariote. Această gena are ambele regiuni conservatoare, la fel pentru toți prokariotele și speciile specifice. Loturi conservative sunt pentru prima reacție în lanț a polimerazei etapă - adăugarea ADN țintă la primeri (porțiuni de ADN de semințe la care a studiat lanț de nucleotide care ar trebui să se alăture pentru a începe analiza restul secvenței) și specii specifice - pentru identificarea speciilor. Gradul de similitudine al parcelelor specifice speciilor reflectă rudenia evolutivă a diferitelor specii. Pentru clonare și analiză ulterioară, puteți utiliza ARN-ul ribozomal însuși, care este prezent în orice celulă într-o cantitate mai mare decât gena corespunzătoare. Secvențele de nucleotide ARN 16S ale tuturor bacteriilor cunoscute și arhaide sunt disponibile pe scară largă. Secvențele identificate sunt comparate cu cele din bazele de date și identifică tipul de bacterii sau se declară aparținând speciei necultivate.

Noua taxonomie
Recent, a fost efectuată o revizuire intensivă a clasificării vechi, fenotipice a bacteriilor pe baza criteriilor slab formalizate - de la apariția coloniilor la preferințele alimentare și de capacitatea de a fi colorate cu diverse coloranți. Noua sistematică se bazează pe criterii moleculare (ARN 16S) și repetă doar parțial fenotipic.

Ce avem înăuntru

Secvențele de codificare ale 16S ARN prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost retrasă direct din „mediu“ - 125 mg de om, rău, scaun a fost inserat în plasmida de E. coli (nu pentru că intestinal, și pentru ca Escherichia coli - o Fave căile de lucru ale biologilor moleculari) și au fost din nou izolate dintr-o cultură de bacterii propagate. Astfel, a fost creată biblioteca genei ARN 16S a tuturor microorganismelor din probă. Apoi, 284 de clone au fost selectate aleator și secvențiate. Sa constatat că doar 24% din secvențele de ARN 16S obținute aparțin unor microorganisme cunoscute anterior. Pentru mai mult de o sută de ani, trei sferturi din microflora din intestinele fiecărei persoane a evitat atenția cercetătorilor înarmați cu metodele de microbiologie clasică! Oamenii de știință pur și simplu nu au putut găsi condițiile pentru cultivarea acestor bacterii, deoarece cei mai capricioși locuitori ai intestinului au refuzat să crească pe mediile microbiologice tradiționale.

Astăzi, folosind metode moleculare, sa stabilit că 10 din 70 de taxoni mari de bacterii sunt reprezentate în microbiota unui adult. Aproximativ 90% dintre microbii noștri aparțin tipului Firmicutes (aceasta include, de exemplu, celebrul lactobacilii - principalul „vinovații“ laptele acrire) și Bacteroidetes - obligã anaerobe (organisme care pot trăi numai în absența oxigenului), care sunt adesea folosite ca un indicator al poluării apelor naturale de canalizare. Restul de 10% din populație împărțită între taxoni Proteobacteria (acestea includ, printre altele, E. coli), Actinobacteria (de la una dintre speciile de actinomicete streptomicina antibiotic a fost izolat), Fusobacteria (locuitori normale ale cavității bucale și adesea cauza periodontita), Verrucomicrobia (recent, în sursa geotermală a fost descoperit sub forma de microbi care se hrănesc cu metan, care abundă în intestin datorită altor microorganisme), cianobacterii (ele sunt încă adesea denumite vechi - „un albastru-verde alge»), spirochete (din fericire nd, nu palid), Synergistes și VadinBE97 (ce fel de animale, întrebați creatorii noii taxonomie a procariote).

Microbian în noi mai mult decât uman

În acest scop, cel mai automatizată, computerizate și tehnologie de înaltă performanță secventiere ADN-ului, oferind o oportunitate de a analiza secvenței de nucleotide scurt, asambla puzzle-ul de mai multe suprapuse „scrisori“ de la capetele acestor site-uri în mod repetat, pentru a repeta această procedură pentru fiecare piesă a genomului și de a primi transcrieri de gene individuale si cromozomi cu la viteze de până la 14 milioane de nucleotide pe oră - ordine de mărime mai rapide decât au făcut-o acum câțiva ani. Deci, sa constatat că microbiota intestinală are aproximativ 100 trilioane de celule bacteriene - de aproximativ zece ori mai mult decât numărul total de celule din corpul uman.

Setul de gene care alcătuiesc metagenomul bacterian este de aproximativ o sută de ori mai mare decât setul de gene ale corpului uman. Dacă vorbim despre volumul de reacții biochimice care au loc în interiorul populației microbiene, este din nou de multe ori mai mare decât volumul reacțiilor biochimice din corpul uman.

Bacteriene „reactoare“ implementează într-un lanț metabolic gazdă care, care nu este capabil să se sprijine - de exemplu, sinteza vitaminelor și a precursorilor acestora, descompunerea unor toxine, descompunerea celulozei în polizaharide digerabile (la rumegătoare), etc...

De la începuturi până la vârstă înaintată

În ciuda faptului că compoziția speciilor microorganismelor intestinale este mai degrabă monotonă, raportul cantitativ dintre reprezentanții anumitor grupuri sistemice din microbiota diferitelor persoane poate varia foarte mult. Dar ce este microflora intestinală normală și care sunt modalitățile de formare a acesteia?

Aceasta intrebare a fost raspuns intr-o lucrare din 2007 a unui grup de biologi americani condusi de Patrick Brown de la Universitatea Stanford. Ei au urmărit formarea de microbioterapie la 14 nou-născuți în timpul primului an de viață. Autorii au reușit să stabilească mai multe surse de colonizare a tractului gastrointestinal. Microbiota copiilor a avut asemănări cu microflora mamei: vaginale, fecale sau microflore ale probelor de lapte matern. În funcție de izvoarele colonizării, în prima microfloră intestinală a sugarilor au existat specii diferite în timpul primului an de viață. Aceste diferențe au rămas semnificative pe întreaga perioadă de studiu, dar la vârsta de un an, formarea microbiotei adulte a devenit vizibilă. Datele interesante au fost obținute pe baza exemplului unei perechi de gemeni. Microflora din ele era aproape identică în compoziție și se schimba în același fel. Această constatare a evidențiat rolul enorm al componentei umane a cuplului microbiotor-gazdă în formarea populației microflorei intestinale. Pentru puritatea experimentului, desigur, ar fi necesar să separăm bebelușii încă în spital (apropo, o poveste minunată pentru un film indian! De-a lungul anilor, gemenii se cunosc reciproc din analizele microflorei). Dar datele din alte studii au confirmat ipoteza că trăsăturile individuale, inclusiv ereditare, ale biochimiei umane au o mare influență asupra compoziției microbiotei.

Subțire și gros

Studiile efectuate în laboratorul lui Jeffrey Gordon (Facultatea de Medicină de la Universitatea Washington, St Louis, Missouri) au permis să asocieze diversitatea speciilor de bacterii ale tractului gastrointestinal cu dieta și trăsăturile metabolice ale individului. Rezultatele experimentului au fost publicate în ediția din decembrie 2006 a revistei Nature. Experiența de un an a sugerat stabilirea unei corelații între excesul de greutate la om și compoziția populației microbiene a intestinelor sale. O duzină de oameni grași care au acceptat să-și pună burta pe altarul științei au fost împărțiți în două grupuri. Unul a mers pe o dietă cu conținut scăzut de grăsimi, cealaltă o dietă cu carbohidrați scăzut. Toți voluntarii au pierdut greutatea și, în același timp, au schimbat raportul celor două grupe principale de microorganisme intestinale: numărul celulelor Firmicutes a scăzut, iar numărul de bacteroide, dimpotrivă, a crescut. La o dietă cu conținut scăzut de grăsimi, o astfel de schimbare a devenit vizibilă mai târziu - după ce pacienții au pierdut 6% din greutatea lor și pe o dietă cu conținut scăzut de carbohidrați - după ce au pierdut primele kilograme (2% din greutatea lor inițială). În acest caz, schimbarea compoziției microflorei a fost cu atât mai pronunțată, cu atât mai puțin a fost greutatea participanților la experiment.

Combaterea obezității

Rezultatele studiului suplimentar efectuat de oamenii de știință asupra modificărilor survenite în organismul microbiologic al șoarecilor simbioși (a se vedea caseta "Testat pe șoareci") au confirmat în mod strălucit ipoteza că microbiota indivizilor obezi contribuie la o prelucrare mai profundă a alimentelor. Comparația probelor ADN de scaun de la șoarecii obezi și normali a arătat că microbiomele obezității sunt saturate cu gene enzimatice care permit o degradare mai eficientă a polizaharidelor. Intestinele de șoareci grași au conținut cantități mari de produse finale de fermentație - compuși ai acizilor acetici și butirici, ceea ce indică o prelucrare mai profundă a componentelor alimentare. Calorimetric (din cuvântul "calorii"!) Analiza probelor de scaun de șoarece a confirmat acest lucru: scaunul de șoareci ob / ob conținea mai puține calorii decât șoarecii de tip sălbatic care nu absorbeau complet energia din alimente.

În plus față de informațiile importante cu privire la componenta „germeni“ de autori de obezitate au fost capabili să demonstreze similitudinea fundamentală între microflora de oameni obezi si soareci, care deschide noi perspective în studiul problemei excesului de greutate, și, eventual, a rezolva această problemă prin „transfer“ microfloră sănătoasă sau formarea sa la pacienții obezi.

Testat pe șoareci

Și cu epuizare

Faptul că microbiota poate controla metabolismul gazdei nu mai este îndoielnică. Laboratorul de cercetare Gordon, dedicat problemei supraponderale, a permis să arunce un pod pentru tratamentul bolilor metabolice. Printre acestea sunt tipurile de epuizare generală, care afectează copiii de la un an la patru ani în țările tropicale sărace, cum ar fi marazmus (la imbecilitate acel cuvânt are doar punct de vedere lingvistic :. marasmoz greacă înseamnă literal epuizare, dispariție) și kwashiorkor (în limba unuia dintre triburile Ghana kwashiorkor - "băiat roșu"). Apariția bolilor este asociată cu o lipsă de proteine ​​și vitamine în timpul tranziției de la alăptare la alimentele adulte. Dar bolile afectează în mod selectiv copiii ai căror frați și surori nu au avut probleme cu tranziția la dieta tradițională pentru regiune. Studiile au arătat că microflora intestinală a copiilor bolnavi este foarte diferită de microflora părinților lor, precum și din microflora fraților și surorilor sănătoși. În primul rând, sa observat absența aproape completă în populația intestinală a Bacteroideților și dominarea speciilor rare aparținând tipurilor de Proteobacteria și Fusobacteria. După ce copiii bolnavi (cu grijă, pentru a nu supradoza!) Au fost hrăniți cu alimente bogate în proteine, microbiota acestora arăta ca una normală, cum ar fi la rude, cu prevalența Bactrotetes și Firmicutes.

Studiile recente nu numai că au schimbat în mod fundamental înțelegerea actuală a microflorei intestinale umane, dar au contribuit și la apariția unui concept care consideră microbiota intestinală ca un "organ" uman multicelulare suplimentar. Un organ compus din diferite linii celulare capabile să comunice atât între ele, cât și cu organismul gazdă. Organismul care redistribuie fluxurile de energie, efectuează reacții fiziologice importante, schimbări sub influența mediului și autoregenerări atunci când schimbările sunt cauzate de condițiile externe. Continuarea studiului "organului bacterian" poate și ar trebui să conducă la înțelegerea legilor funcționării sale, la dezvăluirea conexiunilor sale subtile cu organismul gazdă și, prin urmare, la apariția unor noi metode de combatere a bolilor umane prin tratamentul specific al disfuncțiilor ambelor componente ale metaorganismului.

16s rna analiză

Acizii ribonucleici ribozomali (ARN) sunt mai multe molecule de ARN care formează baza ribozomului. Principala funcție a ARNm este de a efectua procesul de translație - citirea informațiilor din ARNm folosind molecule de adaptor tRNA și catalizarea formării legăturilor peptidice între aminoacizii atașați la tARN.

conținut

Subparticulele ribozomale și nomenclatura ARNm

Pe imaginile microscopice electronice ale ribozomilor intacți, se remarcă faptul că ele constau din două subtipuri de diferite dimensiuni.

Raportul masic al subtilurilor este

2: 1; masă, la rândul lor, exprimată în constante măsurate direct de sedimentare (rata de decantare în unități Svedberg, S) la ultratsentrifugovanii, și este acest parametru a fost baza pentru nomenclatură ARNr și ribozomi și subunitatile ribozomale: denumiri de tip utilizate

De exemplu, ARN ribozomal de procariote cu un coeficient de sedimentare de 16 unități Svedberg este desemnat drept rRNA 16S.

Deoarece coeficienții de sedimentare depind nu numai de greutatea moleculară, ci și de forma particulelor, coeficienții de sedimentare în timpul disocierii sunt neadmitivi: de exemplu, ribozomii bacteriene cu masa moleculară

Dalton are un coeficient de sedimentare de 70S, desemnat ca 70S și disociat în subunitățile 50S și 30S:

Subunitățile ribozomale conțin fiecare câte o moleculă de ARN lungime lungă, a cărei masă este

1/2 - 2/3 din masa subticulei ribozomale, astfel, în cazul ribozomilor 70S bacterieni, subunitatea 50S conține ARN 23S (lungimea

3000 nucleotide) și subunitatea 30S conține ARN rRNA (lungime

1500 nucleotide); subunitatea ribozomală mare, cu excepția „lung“ ARNr conține, de asemenea, una sau două „scurt“ ARNr (5S rARN de 50S bacteriene sau subunitatile ribozomale 5S și 5.8S ARNr bolshii subunitatile ribozomale eucariote).

sinteză

ARN-ul ribozomal formează o proporție mare (până la 80%) din ARN-ul celular total, o astfel de cantitate de ARNr necesită o transcripție intensă a genelor sale de codificare. Această intensitate este asigurată de un număr mare de copii ale genelor care codifică rARN: în eucariote, există de la câteva sute (

200 în drojdie) până la zeci de mii (pentru diferite linii de bumbac, au fost raportate 50-120 de mii de exemplare) de gene organizate în rețele de repetări tandem.

La om, genele care codifică rARN sunt, de asemenea, organizate în grupuri de repetiții tandem localizate în regiunile centrale ale brațului scurt al cromozomului 13, 14, 15, 21 și 22.

Acestea sunt sintetizate prin ARN polimeraza I ca o moleculă lungă de ARN pre-ribozomal, care este tăiat în ARN-uri separate care formează baza ribozomului. În bacterii și archaea, transcrierea inițială include, de obicei, ARN-ul 16S, 23S și 5S, între care se elimină secvențele pre-ARN. De obicei, între genele 16S și 23S rRNA este localizată una sau mai multe gene tARN; astfel, în E. coli, transcrierea inițială a unui astfel de grup de gene are următoarea secvență:

(RRNA 16S) - (1-2 tRNA) - (23S rNAn) - (5S rNAn) - (tRNA 0-2)

O astfel de transcripție este clivată în fragmente de ARN pre-rRNA și tARN prin enzima ribonucleaza III.

La eucariote, ARN 18S, 5.8S și 25/28 sunt co-transcriptați cu ARN polimeraza I, în timp ce gena ARN rSNA este transcrisă cu ARN polimeraza III.

În eucariote, locurile de concentrare a genelor care codifică rARN sunt, de obicei, bine vizibile în nucleul celular, datorită acumulării subunităților ribozomale din jurul lor, care sunt imediat asamblate. Aceste clustere sunt bine colorate cu coloranți citologici și sunt cunoscuți ca nucleolii. În consecință, prezența nucleolilor este caracteristică nu pentru toate fazele ciclului celular: în timpul diviziunii celulare în profază, nucleolul disociază, deoarece sinteza ARN-ului este suspendată și re-formată la sfârșitul telofazei când sinteza ARN-ului este reluată.

Analiza comparativă a ARN-ului pro și eukaryotic

ARN-urile ribozomale (precum ribozomii) de procariote și eucariote diferă una de cealaltă, deși prezintă o similaritate semnificativă între regiunile secvențelor. Ribozomul prokaryotic 70S constă într-o subunitate mare 50S (construită pe baza a două molecule rRNA - 5S și 23S) și o subunitate mică 30S (construită pe baza ARN-ului 16S). Ribosomul eucariot 80S constă într-o subunitate mare 60S (construită pe baza a trei molecule rRNA - 5S, 5.8S și 28S) și o mică subunitate 40S (construită pe baza ARN 18S).

Utilizarea informațiilor despre secvențe

Informațiile despre rRNA ale unui anumit organism sunt folosite în medicină și în biologia evoluționistă.

  • Gena rRNA este una dintre cele mai conservatoare (mai puțin variabile) gene. Prin urmare, poziția sistematică a organismului și timpul de divergență cu speciile apropiate pot fi determinate pe baza unei analize a asemănărilor și diferențelor în secvențele rRNA.
  • ARNr este ținta unui număr mare de antibiotice, unele dintre care sunt utilizate în practica clinică, atât pentru inhibarea creșterii bacteriilor (antibiotice, procariot de legare a ribozomului) și pentru tratamentul bolilor umane (antibiotice se leaga de ribozom eucariota). Primul grup include cloramfenicol, eritromicină, kasugamycin, microcoxină, spectinomicină, streptomicină, tiostrepton. La a doua higromicină B, paromicicină.

Articolul Precedent

Testul de sânge Ahcv ce este

Articole Hepatita